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單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

近年來(lái)，隨著科學(xué)技術(shù)水平的更新?lián)Q代，越來(lái)越多的單細(xì)胞技術(shù)得到了發(fā)展。如人類細(xì)胞圖譜、小鼠細(xì)胞圖譜、小鼠RNA圖譜、小鼠ATAC圖譜和植物細(xì)胞圖譜等大型項(xiàng)目，已經(jīng)產(chǎn)生了大量單細(xì)胞組學(xué)數(shù)據(jù)。通過(guò)空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)和單細(xì)胞多組學(xué)，甚至可以解讀空間動(dòng)態(tài)多級(jí)調(diào)控機(jī)制。這些單細(xì)胞技術(shù)在腫瘤學(xué)、輔助生殖、胚胎發(fā)育和植物育種等領(lǐng)域有許多成功的應(yīng)用。單細(xì)胞測(cè)序通常包括單細(xì)胞基因組測(cè)序，單細(xì)胞表觀測(cè)序，以及單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。我們這里以單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（scRNA-seq）為例來(lái)給大家進(jìn)行介紹。

單細(xì)胞測(cè)序的應(yīng)用

在已經(jīng)擁有RNA-Seq測(cè)序技術(shù)的前提下，我們?yōu)槭裁催€要進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序？單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)之所以重要并被廣泛研究和應(yīng)用，主要是因?yàn)樗哂幸韵聨讉€(gè)關(guān)鍵的優(yōu)勢(shì)和目的：

?  揭示細(xì)胞異質(zhì)性：在傳統(tǒng)的群體細(xì)胞測(cè)序中，只能獲得細(xì)胞群體的平均基因表達(dá)水平，這會(huì)掩蓋細(xì)胞間的個(gè)體差異。單細(xì)胞測(cè)序可以揭示細(xì)胞群體內(nèi)部的異質(zhì)性，識(shí)別不同的細(xì)胞亞群和狀態(tài)。

?  深入理解疾病機(jī)制：單細(xì)胞測(cè)序有助于深入理解復(fù)雜疾病的發(fā)病機(jī)制，如腫瘤的微環(huán)境、不同細(xì)胞類型的相互作用以及疾病進(jìn)展過(guò)程中的細(xì)胞動(dòng)態(tài)變化。

?  精確診斷和治療：通過(guò)對(duì)單個(gè)細(xì)胞的基因表達(dá)和遺傳變異進(jìn)行分析，可以為疾病提供更精確的診斷，并有助于開(kāi)發(fā)個(gè)性化的治療方案。

?  細(xì)胞發(fā)育和分化研究：單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)可以追蹤細(xì)胞分化過(guò)程中的基因表達(dá)變化，揭示干細(xì)胞分化為特定細(xì)胞類型的分子機(jī)制。

?  免疫學(xué)研究：單細(xì)胞測(cè)序有助于研究免疫細(xì)胞的多樣性和功能，理解免疫應(yīng)答的復(fù)雜性，為疫苗開(kāi)發(fā)和免疫治療提供信息。

?  神經(jīng)科學(xué)：在神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域，單細(xì)胞測(cè)序可以揭示不同類型神經(jīng)元的基因表達(dá)特征，增進(jìn)對(duì)大腦功能和神經(jīng)退行性疾病的理解。

?  微生物群落研究：單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)可以分析微生物群落中的物種多樣性和功能，有助于環(huán)境科學(xué)和生態(tài)學(xué)研究。

?  提高研究分辨率：單細(xì)胞測(cè)序提供了一種高分辨率的方法來(lái)研究生物學(xué)問(wèn)題，可以觀察到傳統(tǒng)方法無(wú)法檢測(cè)到的細(xì)微變化。

?  發(fā)現(xiàn)新的生物標(biāo)記物：通過(guò)分析單個(gè)細(xì)胞的基因表達(dá)，可以發(fā)現(xiàn)與疾病相關(guān)的新的生物標(biāo)記物，為早期診斷和治療提供可能。

?  推動(dòng)精準(zhǔn)醫(yī)療：單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)的發(fā)展推動(dòng)了精準(zhǔn)醫(yī)療的進(jìn)步，使得醫(yī)療干預(yù)可以更精確地針對(duì)個(gè)體的細(xì)胞特征。

總之，單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)因其能夠提供細(xì)胞層面的詳細(xì)和全面信息，已成為現(xiàn)代生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究中不可或缺的工具。研究單細(xì)胞測(cè)序的方法有很多，每種單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)的實(shí)驗(yàn)流程都有其特定的步驟和特點(diǎn)。我們通過(guò)以下是幾種常見(jiàn)單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)來(lái)為大家進(jìn)行相應(yīng)的介紹：

? Smart-seq2

★  原理：對(duì)單個(gè)細(xì)胞的mRNA進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄組的擴(kuò)增和測(cè)序。

★  優(yōu)點(diǎn)：提供全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組信息，適合于低通量、高精度的研究。

★  缺點(diǎn)：通量較低，成本較高，不適合大規(guī)模樣本分析。

★  應(yīng)用場(chǎng)景：適用于需要全長(zhǎng)mRNA信息的研究，如可變剪接事件分析、小樣本量的細(xì)胞狀態(tài)研究。

SMART-Seq2實(shí)驗(yàn)原理

? 10X Genomics Chromium

★ 原理：基于微流控技術(shù)和油包水乳液的微滴技術(shù)，每個(gè)微滴包含一個(gè)細(xì)胞和反應(yīng)所需的組分，進(jìn)行cDNA合成和擴(kuò)增。

★ 優(yōu)點(diǎn)：高通量，可同時(shí)處理大量細(xì)胞；使用UMI技術(shù)，減少PCR擴(kuò)增偏倚。

★ 缺點(diǎn)：成本較高；數(shù)據(jù)量較大，需要較強(qiáng)的計(jì)算資源。

★ 應(yīng)用場(chǎng)景：適用于需要大規(guī)模單細(xì)胞分析的研究，如腫瘤異質(zhì)性、免疫細(xì)胞狀態(tài)分析等。

★ 實(shí)驗(yàn)流程：

1. 細(xì)胞分離與裝載：將單個(gè)細(xì)胞分離并通過(guò)微流控技術(shù)裝載到芯片上。

2. 乳液滴生成：形成油包水乳液滴，每個(gè)乳液滴包含一個(gè)細(xì)胞和反應(yīng)組分。

3. 細(xì)胞裂解與cDNA合成：在乳液滴內(nèi)進(jìn)行細(xì)胞裂解和cDNA合成。

4. 文庫(kù)構(gòu)建：cDNA進(jìn)行擴(kuò)增和標(biāo)記，構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)。

5. 測(cè)序：使用Chromium平臺(tái)和Illumina測(cè)序技術(shù)進(jìn)行測(cè)序。

6. 數(shù)據(jù)分析：包括數(shù)據(jù)解包、比對(duì)、定量、聚類分析等。

10× Genomics實(shí)驗(yàn)原理

? Drop-seq

★ 原理：使用微流控技術(shù)，將單個(gè)細(xì)胞與微珠結(jié)合，微珠帶有獨(dú)特的barcode，用于區(qū)分不同細(xì)胞的mRNA。

★ 優(yōu)點(diǎn)：高通量，成本效益高；適用于稀有細(xì)胞類型的分析。

★ 缺點(diǎn)：可能存在較高的dropout率（在單細(xì)胞測(cè)序（single-cell sequencing）中，"Dropout"率是指在測(cè)序過(guò)程中，由于各種原因?qū)е履承┗蚧蜣D(zhuǎn)錄本沒(méi)有被檢測(cè)到的現(xiàn)象。），即某些基因在測(cè)序中未被檢測(cè)到。

★ 應(yīng)用場(chǎng)景：適合于大規(guī)模的細(xì)胞狀態(tài)和類型的分類研究。

★ 實(shí)驗(yàn)流程：

1. 細(xì)胞懸液制備：制備細(xì)胞懸液并通過(guò)微流控技術(shù)進(jìn)行操作。

2. 微珠裝載：細(xì)胞與帶有獨(dú)特barcode的微珠結(jié)合。

3. 乳液滴生成：形成包含細(xì)胞和微珠的乳液滴。

4. 細(xì)胞裂解與cDNA合成：在乳液滴內(nèi)進(jìn)行細(xì)胞裂解和cDNA合成。

5. 文庫(kù)構(gòu)建與擴(kuò)增：構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)并進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

6. 高通量測(cè)序：進(jìn)行高通量測(cè)序。

7. 數(shù)據(jù)分析：包括barcode解復(fù)用、比對(duì)、定量、聚類分析等。

Drop-seq實(shí)驗(yàn)原理

? Micro-well

★ 原理：通過(guò)微孔板技術(shù)，每個(gè)微孔捕獲一個(gè)細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞裂解和cDNA合成。

★ 優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便，成本相對(duì)較低。

★ 缺點(diǎn)：通量受限于微孔板的孔數(shù)，不適合超大規(guī)模樣本。

★ 應(yīng)用場(chǎng)景：適合于中小規(guī)模的單細(xì)胞測(cè)序，如特定細(xì)胞類型的功能研究。

★ 實(shí)驗(yàn)流程：

1.細(xì)胞懸液制備：制備細(xì)胞懸液。

2.細(xì)胞分配：將細(xì)胞分配到微孔板的每個(gè)孔中，理想情況下每個(gè)孔一個(gè)細(xì)胞。

3.細(xì)胞裂解與cDNA合成：在孔中進(jìn)行細(xì)胞裂解和cDNA合成。

4.文庫(kù)構(gòu)建：構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)。

5.高通量測(cè)序：進(jìn)行高通量測(cè)序。

6.數(shù)據(jù)分析：包括數(shù)據(jù)質(zhì)控、比對(duì)、定量、差異表達(dá)分析等。

Micro-well實(shí)驗(yàn)原理

? SPLiT-seq

★ 原理：結(jié)合了微流控技術(shù)和微孔技術(shù)，通過(guò)物理分割單個(gè)細(xì)胞，進(jìn)行測(cè)序。

★ 優(yōu)點(diǎn)：適用于有限的細(xì)胞數(shù)量，可以結(jié)合細(xì)胞表面標(biāo)記進(jìn)行分析。

★ 缺點(diǎn)：技術(shù)操作復(fù)雜，需要特定的設(shè)備和條件。

★ 應(yīng)用場(chǎng)景：適用于有限數(shù)量的細(xì)胞樣本，需要結(jié)合細(xì)胞表面標(biāo)記的研究。

★ 實(shí)驗(yàn)流程：

1.細(xì)胞懸液制備：制備細(xì)胞懸液。

2.細(xì)胞分配：將細(xì)胞分配到微孔板的每個(gè)孔中。

3.物理分割：物理分割每個(gè)孔以確保每個(gè)孔中只有一個(gè)細(xì)胞。

4.細(xì)胞裂解與cDNA合成：在孔中進(jìn)行細(xì)胞裂解和cDNA合成。

5.文庫(kù)構(gòu)建：構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)。

6.高通量測(cè)序：進(jìn)行高通量測(cè)序。

7.數(shù)據(jù)分析：進(jìn)行數(shù)據(jù)質(zhì)控、比對(duì)、定量和聚類分析。

SPLiT-seq實(shí)驗(yàn)原理

? MARS-seq

★ 原理：基于微流控技術(shù)，通過(guò)微滴包裹單個(gè)細(xì)胞，進(jìn)行mRNA捕獲和測(cè)序。

★ 優(yōu)點(diǎn)：能夠提供單細(xì)胞水平的基因表達(dá)數(shù)據(jù)。

★ 缺點(diǎn)：可能存在較高的drop out率和基因檢測(cè)的不穩(wěn)定性。

★ 應(yīng)用場(chǎng)景：適用于需要中等通量單細(xì)胞測(cè)序的研究。

★ 實(shí)驗(yàn)流程：

1.細(xì)胞懸液制備：制備細(xì)胞懸液。

2.微流控技術(shù)：使用微流控技術(shù)將單個(gè)細(xì)胞封裝在微滴中。

3.細(xì)胞裂解與cDNA合成：在微滴中進(jìn)行細(xì)胞裂解和cDNA合成。

4.文庫(kù)構(gòu)建：構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)。

5.高通量測(cè)序：進(jìn)行高通量測(cè)序。

6.數(shù)據(jù)分析：進(jìn)行數(shù)據(jù)質(zhì)控、比對(duì)、定量和聚類分析。

MARS-seq實(shí)驗(yàn)原理

每種技術(shù)的實(shí)驗(yàn)流程都旨在從單個(gè)細(xì)胞中獲取遺傳信息，并將其放大到足以進(jìn)行高通量測(cè)序的水平。數(shù)據(jù)分析是單細(xì)胞測(cè)序的關(guān)鍵部分，需要專業(yè)的生物信息學(xué)工具和方法來(lái)處理和解釋大量的數(shù)據(jù)。

Smart-seq2技術(shù)作為常用的單細(xì)胞RNA測(cè)序技術(shù)之一，它具有一些獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，這些優(yōu)勢(shì)在某些研究場(chǎng)景中具有不可替代性：

1.全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序：

Smart-seq2可以提供單個(gè)細(xì)胞的全長(zhǎng)cDNA序列，這意味著可以獲得完整的mRNA信息，包括所有外顯子和剪接變體。這對(duì)于鑒定和分析可變剪接事件至關(guān)重要。其他技術(shù)可能只能提供部分轉(zhuǎn)錄本信息，無(wú)法全面了解剪接模式。

2.低dropout率：

相比于一些基于標(biāo)簽的方法（如Drop-seq或10X Genomics），Smart-seq2通常具有更低的dropout率，這意味著較少的基因表達(dá)信息在測(cè)序中被遺漏。在研究稀有細(xì)胞類型時(shí)，確保所有基因表達(dá)事件都能被捕獲是非常重要的。Smart-seq2較低的dropout率意味著即使是低豐度的轉(zhuǎn)錄本也更有可能被檢測(cè)到。

3.適用于稀有或珍貴樣本：

由于Smart-seq2可以提供高質(zhì)量的全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，它特別適合用于那些難以獲得大量細(xì)胞或樣本非常珍貴的研究。

4.高靈敏度和準(zhǔn)確性：

Smart-seq2技術(shù)能夠檢測(cè)到低豐度的轉(zhuǎn)錄本，并且由于其較低的dropout率，它在定量基因表達(dá)方面具有較高的準(zhǔn)確性。

5.可變剪接分析：

由能夠獲得完整的轉(zhuǎn)錄本序列，Smart-seq2特別適合于研究可變剪接事件，這對(duì)于理解基因調(diào)控和功能至關(guān)重要。

6.適用于小規(guī)模樣本：

Smart-seq2技術(shù)適合于研究少量細(xì)胞，例如在研究特定類型的細(xì)胞或組織時(shí)，這可能是一個(gè)重要的優(yōu)勢(shì)。例如，可研究的神經(jīng)元樣本數(shù)量有限時(shí)，那么選擇一種能夠提供最全面信息的技術(shù)變得尤為重要。Smart-seq2適合這種情況，因?yàn)樗梢詮纳倭考?xì)胞中捕獲完整的轉(zhuǎn)錄組信息。

7.技術(shù)成熟：

Smart-seq2是一種較早開(kāi)發(fā)的單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)，因此擁有更多的文獻(xiàn)支持和成熟的實(shí)驗(yàn)流程。

全式金生物推出的 TransNGS^? Whole Transcriptome Amplification Kit（KC921）是一款能夠獲得單細(xì)胞全長(zhǎng) cDNA 擴(kuò)增產(chǎn)物的試劑盒，以WTA Oligo(dT) 為逆轉(zhuǎn)錄引物，并應(yīng)用合成效率高、且具有模板置換活性的逆轉(zhuǎn)錄酶在cDNA的3'端添加一段特殊序列，從而得到全長(zhǎng)cDNA產(chǎn)物。一個(gè)單細(xì)胞文庫(kù)通?？梢垣@得10-60 ng的全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組擴(kuò)增產(chǎn)物。

?  產(chǎn)品特點(diǎn)

? 細(xì)胞類型兼容性強(qiáng)，可適用于RNA含量較低的細(xì)胞（如免疫細(xì)胞）

? 組織類型兼容性強(qiáng)，可適用于較難解離的組織（如腦組織）

? 測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量好，文庫(kù)產(chǎn)量高，峰型優(yōu)異，有效檢出基因（FPKM>1）的數(shù)目高

? 樣本兼容體積高達(dá)6 μl，可適配不同濃度RNA或不同數(shù)量細(xì)胞的擴(kuò)增

? 操作時(shí)間短，約3小時(shí)即可完成文庫(kù)構(gòu)建

?  適用范圍

1-105個(gè)哺乳動(dòng)物細(xì)胞或無(wú)細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的真核細(xì)胞（如原生質(zhì)體）

10 pg-100 ng總RNA（含有poly(A)序列的mRNA）

?  實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

? 適用樣本類型廣泛

使用TransGen對(duì)6種不同類型細(xì)胞進(jìn)行全長(zhǎng)cDNA擴(kuò)增，純化后Qubit測(cè)定文庫(kù)濃度，結(jié)果表明，TransGen產(chǎn)品適用于多種類型細(xì)胞，文庫(kù)產(chǎn)量均高于800 ng。

文庫(kù)產(chǎn)量高

文庫(kù)峰型好

使用TransGen對(duì)6種不同類型細(xì)胞進(jìn)行全長(zhǎng)cDNA 擴(kuò)增，純化后Qsep100檢測(cè)文庫(kù)峰型，結(jié)果表明，文庫(kù)峰型覆蓋200-10000 bp，cDNA產(chǎn)物大小符合預(yù)期，峰型無(wú)異常。

測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量高

使用TransGen對(duì)6種不同類型細(xì)胞進(jìn)行全長(zhǎng)擴(kuò)增后進(jìn)行Tn5建庫(kù)，結(jié)果表明，各類型細(xì)胞文庫(kù)測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量高，基因覆蓋度高，有效基因檢出數(shù)（FPKM>1）高。

有效基因檢出數(shù)（FPKM＞1）高

? 樣本投入量范圍廣

文庫(kù)產(chǎn)量高

使用TransGen對(duì)不同投入量的RNA和細(xì)胞樣本進(jìn)行全長(zhǎng)cDNA擴(kuò)增，純化后Qubit測(cè)定文庫(kù)濃度，結(jié)果表明，不同投入量均可獲得較高的文庫(kù)產(chǎn)量，樣本投入量寬泛（10 pg-100 ng）。

文庫(kù)峰型好

使用TransGen對(duì)不同投入量的HeLa細(xì)胞 RNA樣品進(jìn)行全長(zhǎng)cDNA擴(kuò)增， 純化后Qsep100檢測(cè)文庫(kù)峰型，結(jié)果表明，文庫(kù)峰型覆蓋200-10000 bp，cDNA產(chǎn)物大小符合預(yù)期，峰型無(wú)異常。

測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量高

使用TransGen產(chǎn)品對(duì)不同投入量的HeLa細(xì)胞進(jìn)行全長(zhǎng)cDNA擴(kuò)增后進(jìn)行Tn5建庫(kù)，結(jié)果表明，不同投入量的TransGen產(chǎn)品在Q30、總比對(duì)率及平均有效基因數(shù)（gene FPKM >1）表現(xiàn)優(yōu)異，建庫(kù)效果好。 

有效基因數(shù)（FPKM>1）

? 與競(jìng)品比較

文庫(kù)產(chǎn)量更高

使用 TransGen、Company V和Company N產(chǎn)品分別對(duì)10 ng RNA和100個(gè)HeLa細(xì)胞樣本進(jìn)行全長(zhǎng)cDNA擴(kuò)增，純化后Qubit測(cè)定文庫(kù)濃度，結(jié)果表明，TransGen產(chǎn)品的文庫(kù)產(chǎn)量均高于競(jìng)品。

文庫(kù)峰型更好

使用TransGen、Company V和Company N產(chǎn)品分別對(duì)10 ng和100個(gè) HeLa細(xì)胞RNA樣品進(jìn)行全長(zhǎng)cDNA擴(kuò)增，純化后Qsep100檢測(cè)文庫(kù)峰型，結(jié)果表明，文庫(kù)峰型覆蓋200-10000 bp，cDNA產(chǎn)物大小符合預(yù)期，峰型無(wú)異常。

測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量更高

使用TransGen、Company V和Company N產(chǎn)品分別對(duì)10 ng RNA和100個(gè)HeLa細(xì)胞進(jìn)行全長(zhǎng)cDNA擴(kuò)增后進(jìn)行Tn5建庫(kù)，結(jié)果表明，不同投入量的TransGen產(chǎn)品在Q30、總比對(duì)率及平均有效基因數(shù)（gene FPKM >1）表現(xiàn)優(yōu)異，建庫(kù)效果好。

有效基因數(shù)（FPKM>1）

10 ng RNA

100 cells

產(chǎn)品信息