外泌體系列
外泌體（Exosome）由細(xì)胞產(chǎn)生，是直徑介于30-150 nm的磷脂膜分泌性囊泡，廣泛存在并分布在各種體液中（如血清、血漿、唾液、尿液）和細(xì)胞培養(yǎng)液等。目前的主流觀點(diǎn)認(rèn)為，外泌體的產(chǎn)生先是由細(xì)胞膜內(nèi)陷，形成早期內(nèi)小體（Early endosome），成熟晚期內(nèi)小體（Late endosome）的膜向內(nèi)萌發(fā)形成腔內(nèi)小泡（intraluminal vesicles，ILV）并轉(zhuǎn)化為多泡體（multivesicular bodies，MVB）。在MVB與質(zhì)膜融合后，ILV被釋放到細(xì)胞外形成外泌體（Exosome）。外泌體中攜帶有母細(xì)胞的多種蛋白質(zhì)、脂類(lèi)、DNA和RNA等生物活性分子，參與機(jī)體多種生理和病理過(guò)程。
外泌體形成過(guò)程[1]
外泌體的發(fā)展歷程
目前，已有越來(lái)越多的學(xué)者開(kāi)始關(guān)注外泌體在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中的作用及其機(jī)制，外泌體將在癌癥的診斷及治療等領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。有關(guān)外泌體的研究，主要集中在外泌體顆粒的提取、純化和內(nèi)容物分析上。
外泌體的作用
1. 作為藥物的載體進(jìn)行藥物靶向治療
RNA藥物治療是一項(xiàng)極具潛力的治療手段，但是由于難以掌握RNA藥物遞送的穩(wěn)定性和特異性，它的應(yīng)用難度也隨之增加。利用外泌體進(jìn)行RNA的傳遞則可以解決這個(gè)問(wèn)題。例如：將加載融合RVG肽的Lamp2b蛋白的外泌體靜脈注射至小鼠體內(nèi)，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其特異性的敲降了小鼠體內(nèi)BACE1（阿爾茨海默病的治療靶點(diǎn)）的表達(dá)[2]。
2. 作為細(xì)胞間的信號(hào)分子，用于細(xì)胞交流
外泌體作為細(xì)胞間的信號(hào)分子，在細(xì)胞間的信息傳遞中發(fā)揮著重要作用。例如：MPC（肌源性祖細(xì)胞）分泌含有miR-206的外泌體，來(lái)抑制成纖維細(xì)胞中Rrbp1（膠原蛋白合成的主要調(diào)節(jié)劑）的產(chǎn)生，從而防止過(guò)多的膠原蛋白在ECM（細(xì)胞外基質(zhì)）沉積，以穩(wěn)定組織狀態(tài)[3]。外泌體miR-155中miRNA可以調(diào)節(jié)下游細(xì)胞對(duì)胰島素的敏感性[4]。
3. 調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)分子水平，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞活性
外泌體不僅可以作為細(xì)胞間信號(hào)調(diào)節(jié)的載體，也可以主動(dòng)運(yùn)載細(xì)胞內(nèi)各種成分，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞活性。例如：當(dāng)MLKL被RIPK3磷酸化以后，磷酸化的MLKL會(huì)引起細(xì)胞的死亡，然而MLKL產(chǎn)生的外泌體可將磷酸化MLKL裝入囊泡，并分泌到細(xì)胞外，使細(xì)胞免受死亡[5]。
4. 作為分子診斷的Marker，用于疾病的診斷
相比于傳統(tǒng)活檢，液態(tài)活檢取樣方便、對(duì)機(jī)體損傷小。存在于體液和細(xì)胞培養(yǎng)液的外泌體因其特異性和相對(duì)穩(wěn)定性，在作為疾病診斷的Biomaker方面具有很大的潛力。例如：前列腺癌基因3（Prostate Cancer Associated 3，PCA3）、跨膜絲氨酸蛋白酶2 (Transmembrane Serine Proteases 2，TTSPs 2)和ETS 相關(guān)基因（ETS-related gene，ERG）融合基因在PCa患者尿液外泌體中表達(dá)，尿液外泌體具有作為PCa診斷的的潛力[6]。Raimomlo等對(duì)比了腎癌患者尿液中檢測(cè)到的186個(gè)蛋白，發(fā)現(xiàn)其中10個(gè)蛋白的表達(dá)有明顯差異，腎癌患者顯著高表達(dá)MMP9、DKK4和CAIX，且與腫瘤進(jìn)展密切相關(guān)，提示它們有望成為潛在的分子標(biāo)志物，為腎癌診斷和治療提供有價(jià)值的臨床信息[7]。
外泌體的提取方法
目前外泌體常見(jiàn)的提取方法包括超速離心法、密度梯度離心、聚合物沉降法和特異性抗體捕獲等方法。
1. 超速離心法
優(yōu)點(diǎn)：方法簡(jiǎn)單，適合大劑量的樣品處理。
缺點(diǎn)：操作繁瑣，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，離心力可能導(dǎo)致外泌體結(jié)構(gòu)破壞，對(duì)設(shè)備要求高。
2. 密度梯度離心法
優(yōu)點(diǎn)：純度相對(duì)較高，適合大劑量的樣品處理。
缺點(diǎn)：操作繁瑣，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，對(duì)設(shè)備要求高。
3. 聚合物沉降法
優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單，不需要超速離心機(jī)，得到的外泌體數(shù)量較多，適合大劑量的樣品處理。
缺點(diǎn)：雜質(zhì)含量會(huì)比較多，尤其是一些雜蛋白。
4. 分子排阻法
優(yōu)點(diǎn)：純度相對(duì)較高，且外泌體結(jié)構(gòu)不易受到破壞。
缺點(diǎn)：大小相近的顆粒也會(huì)被純化出來(lái)，比如乳糜微粒、低密度脂蛋白等。
5. 超濾法
優(yōu)點(diǎn)：操作方便，富集效率比較高，成本較低。
缺點(diǎn)：外泌體易損耗變形，導(dǎo)致膜堵塞，純度較低，大顆粒蛋白污染嚴(yán)重，附著于膜上的外泌體難以回收，導(dǎo)致提取損失。
6. 磁珠特異性捕獲法
優(yōu)點(diǎn)：外泌體純度較高，并且對(duì)外泌體膜結(jié)構(gòu)影響較小。
缺點(diǎn)：成本較高，無(wú)法進(jìn)行大劑量的提取，磁珠保存難度比較高。
目前外泌體提取方法，普遍存在回收率低，純度低，操作繁瑣，結(jié)構(gòu)不完整等問(wèn)題。針對(duì)上述問(wèn)題，北京全式金生物技術(shù)有限公司開(kāi)發(fā)了兩款外泌體提取新產(chǎn)品，可從血清、血漿、細(xì)胞上清和尿液中提取外泌體，適用于下游的電鏡分析、NTA分析、納米流式（NanoFCM）分析、Western Blot、熒光定量（qPCR）等應(yīng)用。
TransExo? Cell Media Exosome Kit
針對(duì)細(xì)胞上清中外泌體提取、純化的產(chǎn)品，所得的外泌體具有高純度、高活性的優(yōu)點(diǎn)，可以用于Western Blot、透射電鏡、qPCR、粒徑等多種檢測(cè)方式。
● 操作簡(jiǎn)單，無(wú)須超速離心。
● 樣本需求量少，靈敏度高。
電鏡檢測(cè)
使用TransGen和Company Q產(chǎn)品提取MDA-MB-231和Hela細(xì)胞上清中外泌體，
電鏡檢測(cè)結(jié)果顯示均可檢測(cè)到結(jié)構(gòu)完整的外泌體。
外泌體標(biāo)志性蛋白檢測(cè)
MDA-MB-231 細(xì)胞分別進(jìn)行饑餓誘導(dǎo)處理和無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，使用 TransGen 產(chǎn)品和 Company Q 產(chǎn)品提取細(xì)胞上清中的外泌體，WB 檢測(cè)結(jié)果顯示均可檢測(cè)到外泌體的標(biāo)志蛋白 TSG101、CD63、CD81。
外泌體RNA檢測(cè)
使用 TransGen 和 Company Q 產(chǎn)品成功提取外泌體后進(jìn)行 total RNA 提取，反轉(zhuǎn)錄后定量檢測(cè)miRNA (miR-92a)、lncRNA (RN7SL)、mRNA (MTND4) 表達(dá)。結(jié)果顯示均可檢測(cè)到三種 RNA 表達(dá)。
適用于多種細(xì)胞上清外泌體提取
TransGen 產(chǎn)品提取不同種類(lèi)細(xì)胞上清中的外泌體，WB 檢測(cè)結(jié)果顯示均可檢測(cè)到
外泌體的標(biāo)志蛋白 TSG101。
TransExo? PS Exosome Isolation Kit (FE601)
以磁珠為核心原料，通過(guò)磷酯酰絲氨酸（Phosphatidylserine，PS）親和受體蛋白的作用，特異性捕獲血清、肝素血漿、尿液、細(xì)胞培養(yǎng)上清等多種樣本中的外泌體。提取的外泌體適用于Western Blot、qPCR、電鏡、納米粒子追蹤等多種檢測(cè)，同時(shí)可用于細(xì)胞共培養(yǎng)。
? 操作簡(jiǎn)單，無(wú)需超速離心，能夠在3 小時(shí)內(nèi)完成外泌體純化。
? 相較于超速離心法，特異性更強(qiáng)，純度更高。
? 洗脫條件溫和，提取的外泌體形態(tài)良好，結(jié)構(gòu)完整，活性高。
原理示意圖
粒徑檢測(cè)
使用TransGen 產(chǎn)品提取HEK-293T 細(xì)胞上清、血清和尿液中的外泌體，經(jīng)粒徑檢測(cè)，提取的外泌體平均粒徑在100 nm左右。
電鏡檢測(cè)
使用TransGen 產(chǎn)品提取HEK-293T 細(xì)胞上清、血漿和尿液中的外泌體，
經(jīng)電鏡檢測(cè)，提取的外泌體呈經(jīng)典的盤(pán)狀囊泡形態(tài)，結(jié)構(gòu)完整。
外泌體標(biāo)志性蛋白檢測(cè)
使用TransGen 產(chǎn)品提取血清、血漿、尿液和多種類(lèi)型細(xì)胞上清中的外泌體，WB 檢測(cè)外泌體標(biāo)志物CD63 和TSG101 的表達(dá)。
外泌體 RNA 檢測(cè)
使用TransGen 產(chǎn)品提取不同種類(lèi)樣本的外泌體后進(jìn)行total RNA 提取，可檢測(cè)到多種miRNA(has-miR-150-3p、has-miR-16-1-3p、
has-let-7a-5p、has-miR-92a-3p) 、lncRNA(RN7SL)、mRNA(Actin) 的表達(dá)。
活性檢測(cè)
在MDA-MB-231 細(xì)胞中加入TransGen 產(chǎn)品提取的外泌體后，細(xì)胞遷移率隨著加入外泌體的含量增加而提高，表明提取的外泌體具有生物活性。
與沉淀法提取外泌體的比較
分別用磁珠法和沉淀法提取HEK-293T 細(xì)胞上清的外泌體，WB 檢測(cè)相同總蛋白中的
外泌體標(biāo)志物CD63 和CD81 的表達(dá)，結(jié)果表明，磁珠法提取的外泌體純度更高。
外泌體是由細(xì)胞分泌的膜性小囊泡，攜帶著細(xì)胞來(lái)源的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、DNA和RNA等分子。這些物質(zhì)作為細(xì)胞間的信號(hào)分子，用于細(xì)胞間交流。開(kāi)展外泌體中RNA研究，有助于深入了解外泌體的作用。全式金生物開(kāi)發(fā)了針對(duì)血清/血漿中外泌體RNA提取新產(chǎn)品，可提取血清/血漿中外泌體中的總RNA。
外泌體相關(guān)產(chǎn)品推薦
參考文獻(xiàn)
[1] Roles of Exosomes in Ocular Diseases.
[2] Delivery of siRNA to the mouse brain by systemic injection of targeted exosomes.
[3] Myogenic Progenitor Cells Control Extracellular Matrix Production by Fibroblasts during Skeletal Muscle Hypertrophy.
[4] Adipose Tissue Macrophage-Derived Exosomal miRNAs Can Modulate In Vivo and In Vitro Insulin Sensitivity.
[5] MLKL,the Protein that Mediates Necroptosis, Also Regulates Endosomal Trafficking and Extracellular Vesicle Generation.
[6] Prostate cancer-derived urine exosomes: a novel approach to biomarkers for prostate cancer.
[7] Differential protein profiling of renal cell carcinoma urinary exosomes.
