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文章題目：Structural basis for intrinsic transcription termination
期刊：Nature
發(fā)表時間：2023年1月11日
主要內(nèi)容：中國科學(xué)院分子植物科學(xué)卓越創(chuàng)新中心合成生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室張余研究團(tuán)隊(duì)和美國威斯康辛大學(xué)麥迪遜分校Robert Landick團(tuán)隊(duì)以及浙江大學(xué)馮鈺團(tuán)隊(duì)合作在Nature雜志上發(fā)表了文章Structural basis for intrinsic transcription termination，該研究捕獲了細(xì)菌固有轉(zhuǎn)錄終止的中間狀態(tài)冷凍電鏡結(jié)構(gòu)，揭示了細(xì)菌RNA聚合酶識別終止序列、停止轉(zhuǎn)錄并解離RNA的分子機(jī)制。
原文鏈接：http://www.nature.com/articles/s41586-022-05604-1
使用TransGen產(chǎn)品：
pEASY?-Basic Seamless Cloning and Assembly Kit（CU201）
研究背景
轉(zhuǎn)錄是基因表達(dá)的第一步，是遺傳中心法則的重要組成。RNA聚合酶以DNA為模板進(jìn)行的轉(zhuǎn)錄分為轉(zhuǎn)錄起始、轉(zhuǎn)錄延伸和轉(zhuǎn)錄終止三個階段。高效和準(zhǔn)確的終止是所有生物基因轉(zhuǎn)錄所必需的，轉(zhuǎn)錄終止異常會引起RNA降解、干擾下游基因表達(dá)、干擾DNA復(fù)制、破壞基因組穩(wěn)定性等。RNA聚合酶一般通過兩種途徑終止轉(zhuǎn)錄，一條途徑是依賴于終止因子的轉(zhuǎn)錄終止，例如細(xì)菌RNA聚合酶依賴具有RNA解旋酶活性的Rho因子終止轉(zhuǎn)錄，動植物細(xì)胞Pol II依賴具有RNA外切酶活性的XRN終止mRNA轉(zhuǎn)錄。另一種是不依賴于終止因子的轉(zhuǎn)錄終止，也稱為固有轉(zhuǎn)錄終止。固有轉(zhuǎn)錄終止是噬菌體、細(xì)菌和真核生物RNA聚合酶（Pol III）保守的轉(zhuǎn)錄終止方式。
文章概述
在轉(zhuǎn)錄終止環(huán)節(jié)，RNA聚合酶需要從高速的延伸狀態(tài)（～50 堿基/秒）緊急剎車停止轉(zhuǎn)錄，隨后RNA聚合酶迅速發(fā)生構(gòu)象變化，RNA和DNA從高度穩(wěn)定的RNAP-DNA-RNA復(fù)合物解離。由于轉(zhuǎn)錄終止具有高度動態(tài)和反應(yīng)迅速的特征，因此解析轉(zhuǎn)錄終止的結(jié)構(gòu)和分子機(jī)制具有較大難度。研究團(tuán)隊(duì)借鑒前人的研究成果，拆分了轉(zhuǎn)錄終止序列，捕獲了三個關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄終止中間態(tài)結(jié)構(gòu)。首先解析了只包含U-tract序列的TTC-pause冷凍電鏡結(jié)構(gòu)。其次，解析了包含U-tract序列和部分RNA發(fā)卡的TTC-hairpin結(jié)構(gòu)。最后，利用antisense RNA模擬形成完整的發(fā)卡結(jié)構(gòu)并誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄終止，解析了TTC-release的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)。據(jù)此，研究團(tuán)隊(duì)提出了固有轉(zhuǎn)錄終止的四個反應(yīng)步驟：
1. 轉(zhuǎn)錄暫停（TTC-pause）：Poly U序列阻止RNAP結(jié)合NTP，誘發(fā)轉(zhuǎn)錄暫停。
2. RNA發(fā)卡部分折疊（TTC-hairpin）：RNA發(fā)卡折疊進(jìn)入RNA聚合酶的RNA退出通道，誘導(dǎo)RNA聚合酶構(gòu)象變化，削弱RNAP和RNA-DNA雜合雙鏈的相互作用。
3. 轉(zhuǎn)錄泡DNA閉合（TTC-rewinding）：轉(zhuǎn)錄泡的兩條DNA單鏈堿基重新配對，破壞RNA-DNA雜合雙鏈。
4. RNA釋放（TTC-release）：RNA聚合酶釋放RNA，但仍可以在基因組上自由滑動，最終解離或者滑動至啟動子DNA開始下一輪轉(zhuǎn)錄。
圖1：細(xì)菌固有轉(zhuǎn)錄終止機(jī)制模型
該研究報(bào)導(dǎo)了細(xì)菌固有轉(zhuǎn)錄終止關(guān)鍵中間態(tài)的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)，還原了細(xì)菌固有轉(zhuǎn)錄終止的全過程，揭示了細(xì)菌RNA聚合酶在轉(zhuǎn)錄終止序列暫停轉(zhuǎn)錄以及RNA發(fā)卡結(jié)構(gòu)在RNAP內(nèi)部折疊并誘導(dǎo)RNA釋放的分子機(jī)制。回答了細(xì)菌RNA聚合酶如何識別轉(zhuǎn)錄終止序列、暫停轉(zhuǎn)錄、釋放RNA的分子機(jī)制。該研究拓展了人們對于轉(zhuǎn)錄終止的認(rèn)識，提出的“DNA-rewinding triggered RNA release”的機(jī)制為真核RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄終止機(jī)制提供了參考。
全式金產(chǎn)品支撐
優(yōu)質(zhì)的試劑是科學(xué)研究的利器。全式金的無縫克隆試劑盒pEASY?-Basic Seamless Cloning and Assembly Kit（CU201）助力本研究。
pEASY?-Basic Seamless Cloning and Assembly Kit（CU201）
本產(chǎn)品利用特殊的重組酶和同源重組的原理，可以將任意方法線性化后的載體和與其兩端具有15-25 bp重疊區(qū)域的PCR片段定向重組，可以實(shí)現(xiàn)1-5個片段的高效無縫拼接。多次榮登Nature、Science、Nature Biotechnology等知名期刊，助力科學(xué)研究。
? 產(chǎn)品特點(diǎn)：
? 快速：僅需要15分鐘反應(yīng)時間。
? 簡單：不受片段酶切位點(diǎn)的影響，無需對片段酶切。
? 高效：陽性率達(dá)95%以上。
? 無縫：不引入額外的序列。
? 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
? 不同長度單片段連接
將不同長度PCR片段（50 bp、2 kb、5 kb、8 kb）分別插入PG載體后，分別用內(nèi)切酶酶切鑒定插入效果。結(jié)果顯示，不同長度的PCR片段均正確插入PG載體。
? 不同長度多片段連接
將不同長度PCR片段(600 bp，900 bp，1200 bp，1500 bp，1800 bp，片段兩端設(shè)計(jì)Nde I酶切位點(diǎn))，混合后插入pUC19載體后，使用Nde I內(nèi)切酶酶切鑒定插入效果。結(jié)果顯示，不同長度的PCR片段均正確插入pUC19載體。
全式金產(chǎn)品再一次登上Nature期刊，證明了大家對全式金產(chǎn)品品質(zhì)和實(shí)力的認(rèn)可，也完美詮釋了全式金一直以來秉承的“品質(zhì)高于一切，精品服務(wù)客戶”的理念。全式金始終在助力科研的道路上砥礪前行，希望未來能與更多的科研工作者并肩奮斗，用更多更好的產(chǎn)品持續(xù)助力科研。
使用pEASY?-Basic Seamless Cloningand Assembly Kit（CU201）產(chǎn)品發(fā)表的部分文章：
? You L L, Omollo E O, Yu C Z, et al. Structural basis for intrinsic transcription termination [J]. Nature, 2023.
? Liu R, Yang J, Yao J, et al. Optogenetic control of RNA function and metabolism using engineered light-switchable RNA-binding proteins[J]. Nature Biotechnology, 2022.
? Chen Q, Hu T, Li X, et al. Phosphorylation of SWEET sucrose transporters regulates plant root: shoot ratio under drought[J]. Nature plants, 2022.
? Wu M, Xu G, Han C, et al. lncRNA SLERT controls phase separation of FC/DFCs to facilitate Pol I transcription[J]. Science, 2021.
? Dou W, Zhu Q, Zhang M, et al. Screening and evaluation of the strong endogenous promoters in Pichia pastoris[J]. Microbial cell factories, 2021.
