核仁是真核細(xì)胞間期核中最明顯的結(jié)構(gòu)。它位于細(xì)胞核中。為生殖做出了貢獻，并聚集著核糖體。曾經(jīng)集合的核糖體從細(xì)胞核中出來，進入細(xì)胞質(zhì)。對核仁結(jié)構(gòu)、動態(tài)和功能的研究,不僅為早期細(xì)胞學(xué)家所密切注意,而且在20世紀(jì)60年代發(fā)現(xiàn)核仁的重要功能以后,也一直受到各相關(guān)領(lǐng)域研究者的高度重視。
2021年7月30日，中國科學(xué)院分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心（生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所）陳玲玲研究組和劉珈泉研究組在《Science》發(fā)表了合作研究成果“l(fā)ncRNA SLERT controls phase separation of FC/DFCs to facilitate Pol I transcription”，并獲同期Perspectives專評。該研究首次揭示了長非編碼RNA SLERT以RNA分子伴侶機制改變互作核仁蛋白DDX21構(gòu)象進而影響FC/DFC區(qū)域的大小和流動性，維持RNA聚合酶I高效轉(zhuǎn)錄生成核糖體RNA。
（A）左上：體外相分離實驗中，纖維狀DDX21的形成隨蛋白濃度降低而減弱；左下：在不同的實驗體系中，不同濃度的DDX21蛋白呈現(xiàn)不同的分子狀態(tài)，SLERT可以增加DDX21蛋白的流動性；右：體內(nèi)實驗和體外重構(gòu)實驗中，SLERT通過結(jié)合DDX21增加FC/DFC轉(zhuǎn)錄單元的大小和流動性。
（B）DDX21分子抱團聚集在核仁DFC區(qū)域的外側(cè)，并且限制FC/DFC區(qū)域的大小和流動性。SLERT調(diào)控DDX21的構(gòu)象由開放轉(zhuǎn)為閉合，DDX21分子呈現(xiàn)低聚的疏松狀態(tài)，為Pol I的高效轉(zhuǎn)錄提供合適的空間環(huán)境。Pol I轉(zhuǎn)錄發(fā)生在FC和DFC的交界處，DDX21卷曲纏繞rDNA阻止Pol I轉(zhuǎn)錄復(fù)合物在rDNA的占位。SLERT調(diào)控DDX21的構(gòu)象和流動性抑制DDX21對rDNA的纏繞從而促進Pol I轉(zhuǎn)錄。
該工作首次發(fā)現(xiàn)SLERT以RNA分子伴侶機制調(diào)控蛋白質(zhì)的構(gòu)象和多聚狀態(tài)并且觀察到單分子水平下蛋白質(zhì)微觀相分離的功能特征和調(diào)控機制。蛋白質(zhì)的多聚狀態(tài)與其流動性，分子間相互作用以及功能發(fā)揮直接相關(guān)，RNA分子伴侶通過跨越數(shù)量級調(diào)控核仁蛋白質(zhì)相分離特性維持細(xì)胞核仁正常的形態(tài)功能，對lncRNA領(lǐng)域和相分離領(lǐng)域的深入研究具有重大意義。
全式金無縫拼接系列產(chǎn)品pEASY?-Basic Seamless Cloning and Assembly Kit(CU201)與感受態(tài)細(xì)胞產(chǎn)品Transetta(DE3) Chemically Competent Cell(CD801)攜手助力該項研究。
產(chǎn)品優(yōu)勢：
1、pEASY?-Basic Seamless Cloning and Assembly Kit(CU201)
利用特殊的重組酶和同源重組的原理，可以將任意方法線性化后的載體和與其兩端具有15-25 bp 重疊區(qū)域的PCR 片段定向重組，可實現(xiàn)1-5 個片段的高效無縫拼接。
- 快速：僅需要15分鐘反應(yīng)時間。
- 簡單：不受片段酶切位點的影響，無需對片段酶切。
- 高效：陽性率達95%以上。
- 無縫：不引入額外的序列。
單片段高效連接實驗
1 kb PCR 片段插入pUC19 載體后，PCR 鑒定插入效果。結(jié)果顯示，插入片段的陽性率達100%。
單片段插入后，挑取60 個單克隆菌落進行PCR 鑒定
M: Trans2K? Plus II DNA Marker
不同長度單片段連接實驗
不同長度PCR片段（50 bp、2 kb、5 kb、8 kb）分別插入PG載體后，分別用內(nèi)切酶酶切鑒定插入效果。結(jié)果顯示，不同長度的PCR片段均正確插入PG載體。
單片段插入后酶切
不同長度多片段連接實驗
不同長度PCR片段(600 bp，900 bp，1200 bp，1500 bp，1800 bp，片段兩端設(shè)計Nde I酶切位點)，混合后插入pUC19載體后，Nde I酶切鑒定插入效果。結(jié)果顯示，不同長度的PCR片段均正確插入pUC19載體。
多片段插入后酶切
2、Transetta(DE3) Chemically Competent Cell(CD801)
Transetta（DE3）是采用進口菌株，特殊工藝制作，可用于DNA的化學(xué)轉(zhuǎn)化。細(xì)胞具有氯霉素(Camr)抗性。使用pUC19質(zhì)粒DNA檢測，轉(zhuǎn)化效率可達107 cfu/μg DNA。使用Control Plasmid I (Amp+)用于檢測細(xì)胞是否具有表達功能，表達蛋白大小為25 kDa。
特點
該菌株是攜帶氯霉素抗性質(zhì)粒BL21的衍生菌，補充大腸桿菌缺乏的6種稀有密碼子（AUA， AGG， AGA，CUA， CCC， GGA）對應(yīng)的tRNA，提高外源基因，尤其是真核基因在原核系統(tǒng)中的表達水平。
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