Q：蛋白不表達(dá)或表達(dá)量很低？
A：
1、選擇正確的表達(dá)載體與表達(dá)菌株
? T7啟動(dòng)子的載體(如pET系列載體)應(yīng)選用BL21(DE3)，BL21(DE3) pLysS，Transetta(DE3) 等菌株。非T7啟動(dòng)子的表達(dá)載體 (如Tac啟動(dòng)子的pGEX、pMAL系列表達(dá)載體) 應(yīng)選用BL21表達(dá)菌株。
? 對細(xì)胞有毒性的蛋白，建議選用背景表達(dá)低、嚴(yán)謹(jǐn)調(diào)控誘導(dǎo)的菌株，如BL21(DE3) pLysS菌株。
? 對于帶有稀有密碼子的蛋白或來源于真核基因的蛋白，建議選用Transetta(DE3) 等菌株。
2、嘗試不同的表達(dá)載體與菌株
不同的蛋白，對不同載體與菌株的偏好不同，如果某一蛋白無法通過優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)條件得到明顯改善，可以更換其它菌株或表達(dá)載體。
3、表達(dá)條件的優(yōu)化
? 選擇不同的培養(yǎng)基。對于某些蛋白，在培養(yǎng)基中加入適量的葡萄糖(0.1%-0.5%)，可以明顯提高表達(dá)量。
? 較高的溫度、較高的誘導(dǎo)物濃度、較長的表達(dá)時(shí)間，一般可以加快表達(dá)的速度，促進(jìn)目的蛋白的積累，從而提高表達(dá)量。但可能會降低可溶蛋白的表達(dá)量，形成包涵體。
? 細(xì)胞的生長狀態(tài)對蛋白表達(dá)有很大的影響，可以通過測量菌液的OD600值監(jiān)測生長狀態(tài)。對于大部分蛋白，應(yīng)在菌株的對數(shù)生長期(OD600=0.5) 進(jìn)行誘導(dǎo)。
Q：目的蛋白不可溶，形成包涵體？
A：
首先確認(rèn)目的蛋白是否有表達(dá)。
? 裂解菌體并離心后，通過對全菌、上清、沉淀的檢測，確認(rèn)目的蛋白是否表達(dá)，是否形成了包涵體。
? 包涵體的形成與蛋白自身結(jié)構(gòu)、表達(dá)系統(tǒng)、誘導(dǎo)表達(dá)條件等因素有著密切關(guān)系。在無法改變蛋白自身結(jié)構(gòu)的情況下，可以嘗試不同的表達(dá)載體與菌株，增強(qiáng)其溶解能力，優(yōu)化出適合特定蛋白的表達(dá)系統(tǒng)。
? 目前認(rèn)為包涵體的形成是由于蛋白在細(xì)胞內(nèi)積累速度過快，沒有正確折疊而聚集沉淀?？梢酝ㄟ^優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)條件，如降低誘導(dǎo)溫度、降低誘導(dǎo)物濃度、縮短表達(dá)時(shí)間、降低誘導(dǎo)時(shí)菌液的OD值等，以減緩蛋白的積累。
Q：目的蛋白大小不正確？
A：
? 蛋白的結(jié)構(gòu)對判斷分子量大小有一定影響?？梢酝ㄟ^加熱變性蛋白，從而準(zhǔn)確判斷蛋白分子量大小。
? 確認(rèn)蛋白表達(dá)是否完整，蛋白是否提前終止表達(dá)。
? 若形成二聚體甚至多聚體，可以通過加熱變性蛋白、打開二硫鍵 (加入DTT、β-ME等還原劑) 等手段，破壞次級結(jié)構(gòu)，準(zhǔn)確判斷分子量大小。
RNA純化常見問題解答
Q：提取過程中 RNA 降解
A：
? 材料中的 RNA 發(fā)生降解：盡量選擇新鮮的材料，材料采集后應(yīng)迅速用液氮處理。材料
保存在液氮中或 -70℃條件下，材料均不宜長期保存，且避免反復(fù)凍融。幼嫩新鮮的材料 RNA 含量高且完整，衰老或病害等受損的材料中 RNA 降解比較嚴(yán)重。
? 操作環(huán)境的 RNase 污染：RNA 提取盡量選擇潔凈的環(huán)境，由于自然條件下空氣中含有較多的 RNase，建議對提取環(huán)境進(jìn)行 RNase 的清除處理。
? 提取用具帶來的 RNase污染：提取用所有的玻璃器皿可通過高溫滅活 (160℃烘烤 4-5 小時(shí))去除 RNase。RNA 材料所接觸的所有塑料制品 (如槍頭、電泳槽、移液器等)都需要通過 DEPC 或 NaOH 處理嚴(yán)格去除 RNase 后才可使用。
? 操作中帶入的 RNase 污染：人的皮膚、汗液和呼出的氣體中含有大量的 RNase。操作人
員可通過經(jīng)常更換一次性手套，佩戴口罩等措施減少此類污染。
Q：RNA 提取量低
A：
? 材料 RNA 含量較低：對于 RNA 含量較低的纖維組織 (肌肉組織或纖維素較高的植
物組織) 可適當(dāng)提高起始材料的用量。
? 材料中蛋白和脂肪含量較高：蛋白和脂肪含量較高的材料可用氯仿對上清再次抽提。
? RNA 沉淀?xiàng)l件不合適：使用異丙醇沉淀 RNA 時(shí)，加入的異丙醇與提取液的比例為嚴(yán)
格的 1:1，否則會明顯影響 RNA 沉淀的效率和 RNA 的純度。特殊材料 (如含有多糖、多酚等) 可通過添加適量的檸檬酸鈉來改善沉淀效果。
Q：RNA 中有基因組 DNA 污染
A：
? 材料中核酸含量高：脾臟、胸腺等組織中的核酸含量較高，可進(jìn)行多次酚 / 氯仿抽
提以去除多余的 DNA。也可以在提取后加入 DNase I 處理，降解 DNA。
? 材料過量：增加試劑用量。
? RNA 沉淀?xiàng)l件不合適：使用異丙醇沉淀 RNA 時(shí)，加入的異丙醇與提取液的比例偏高，
溶液的 pH 值偏小，都容易使 DNA 形成沉淀。
Q：提取后的 RNA 樣品降解
A：
? RNA 樣品反復(fù)凍融：反復(fù)凍融會使 RNA 片段斷裂，影響 RNA 的完整性。
? RNA 樣品保存條件不合適：根據(jù)保存時(shí)間和材料的不同，RNA 應(yīng)保存在不同的溶液中。
如從胰臟、肝臟等 RNase 含量較高的材料中提取的樣品需要儲存在甲醛或甲酰胺中以保存高質(zhì)量的 RNA，而在脾臟中提取的 RNA 可在水中長期穩(wěn)定保存。
