Q: 擴(kuò)增效率低：條帶較弱或無(wú)擴(kuò)增
A：
? 酶的原因：實(shí)驗(yàn)表明，PCR酶對(duì)于DNA具有一定的偏好性。如使用一種酶經(jīng)過(guò)優(yōu)化難以獲得理想擴(kuò)增時(shí)，可以嘗試其它PCR酶。
? 模板引物的原因：確保模板、引物的品質(zhì)，保證沒(méi)有降解。另外，如果模板含有較多的抑制物時(shí)（如植物基因組模板），推薦使用抗抑制能力強(qiáng)的PCR酶；還可以對(duì)模板進(jìn)行梯度稀釋后擴(kuò)增，摸索合適的模板用量。
? 反應(yīng)體系與條件的原因：增加循環(huán)數(shù)、降低退火溫濕度、適當(dāng)提高M(jìn)g2+工作濃度，都可以提高擴(kuò)增效率，但同時(shí)會(huì)導(dǎo)致特異性與保真性下降，需要根據(jù)具體的實(shí)驗(yàn)要求優(yōu)化合適的條件。
Q: 擴(kuò)增特異性差：引物二聚體、雜帶、拖尾等
A:
? 選擇熱啟動(dòng)酶：與普通PCR酶相比，熱啟動(dòng)酶具有更高的擴(kuò)增效率和特異性。
? 優(yōu)化反應(yīng)體系與條件：升高退火溫度可以有效提高特異性。另外減少循環(huán)數(shù)、適當(dāng)降低Mg2+工作濃度，也可以提高特異性，但都會(huì)導(dǎo)致擴(kuò)增效率的下降，需要根據(jù)具體的實(shí)驗(yàn)要求優(yōu)化合適的條件。還可以嘗試某些特殊的程序，如巢式PCR、Touch Down PCR等。
? PCR產(chǎn)物需要進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)時(shí)，如果確定有目的條帶擴(kuò)增，可以凝膠回收目的條帶。
Q：擴(kuò)增保真性差：突變、插入、缺失等
A：
? 選擇高保真酶：B型DNA聚合酶，如Pfu系列酶，具有3’-5’的外切酶活性，能夠校正錯(cuò)配的堿基，具有高保真性。另外，復(fù)合酶中由于有B型DNA聚合酶的存在，也具有較高的保真性，但保真性比B型DNA聚合酶要低。
? 優(yōu)化PCR體系與條件：適當(dāng)增加模板量、減少循環(huán)數(shù)，可以降低突變機(jī)率，提高保真性。
確認(rèn)保真性低的原因：有時(shí)保真性低并非由PCR引起，PCR通常只會(huì)導(dǎo)致數(shù)量很少的單堿基突變。如果產(chǎn)物測(cè)序后，發(fā)現(xiàn)大量的突變，或有明顯的插入、缺失等，很可能是來(lái)自其它實(shí)驗(yàn)步驟，如DNA在大腸桿菌中復(fù)制是發(fā)生重組，或是測(cè)序時(shí)的污染。這種情況，可以重新反轉(zhuǎn)錄或選保真性更高的反轉(zhuǎn)錄酶。
Q：Pfu酶擴(kuò)增如何加“A”？
A：
? 在10 μl體系中，加入純化后PCR產(chǎn)物、0.2 μl Taq DNA Polymerase、0.5 μl 10 mM dNTP (或0.5 μl 2.5 mM dATP)、1 μl 10xTaq Buffer， 72℃ 反應(yīng)10-15分鐘即可。
Q：出現(xiàn)假陽(yáng)性擴(kuò)增
A：
? 引物設(shè)計(jì)不合適：選擇的擴(kuò)增序列與非目的擴(kuò)增序列有同源性，因而在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性。需重新設(shè)計(jì)引物。
? 靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染：一是整個(gè)基因組或大片段的交叉污染，導(dǎo)致假陽(yáng)性。這種假陽(yáng)性可用以下方法解決：操作時(shí)應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及樣進(jìn)槍頭等均應(yīng)一次性使用。必要時(shí)，在加標(biāo)本前，反應(yīng)管和試劑用紫外線(xiàn)照射，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性?？苫ハ嗥唇?，與引物互補(bǔ)后，可擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物，而導(dǎo)致假陽(yáng)性的產(chǎn)生，可用巢式PCR方法來(lái)減輕或消除。
