Q：如何選擇合適的克隆載體？
A：Taq系列酶擴(kuò)增的片段，選用T載體；Pfu系列酶擴(kuò)增片段，選用Blunt系列載體，也可以加“A”后和T載體連接，但效果不如直接連接Blunt系列載體。如果PCR模板是質(zhì)粒DNA，推薦使用雙抗性載體。
Q：插入片段的量多少合適？
A：
? 片段加入量可根據(jù)片段長(zhǎng)度不同進(jìn)行調(diào)整。 最佳插入片段DNA量：載體與片段摩爾比=1:7
? 可以粗略的按照“1 kb 20 ng”的比例計(jì)算。(如1 kb加20 ng，1.5 kb加30 ng等)、(在膠上通過TransGen的DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)粗定量即可)
? 片段加入量最大為4μl，即使片段濃度很低也不要超過此限。片段加入量最少為0.5μl，可以補(bǔ)充無菌水以方便操作。
? 反應(yīng)溫度范圍：20-37℃，最適反應(yīng)溫度為25℃。
Q：反應(yīng)時(shí)間多長(zhǎng)合適？
A：
? 大多數(shù)1 kb以內(nèi)的PCR產(chǎn)物室溫反應(yīng)5分鐘即可完成反應(yīng)。以下幾種情況可以延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間以獲得更理想的效果：
? 具有特殊結(jié)構(gòu)(高AT/高GC/反向重復(fù)序列)的片段：10-20分鐘。
? 膠回收片段或加"A"片段：10-15分鐘(該條件適用于3 kb以內(nèi)的片段)。
? 大于3 kb的PCR產(chǎn)物需延長(zhǎng)至15-20分鐘。
Q：連接產(chǎn)物可以保存多久？
A：連接產(chǎn)物可以置于-20℃或2-8℃冰箱，一周內(nèi)使用。
Q：多克隆位點(diǎn)上的酶切位點(diǎn)切不開？
A：篩選到的克隆來源于模板質(zhì)粒而不是連接產(chǎn)物。推薦使用雙抗載體，篩選時(shí)使用模板質(zhì)粒不具有的抗性。
Q：克隆數(shù)少或陽性率低？
A：
? 影響克隆數(shù)目和克隆效率的因素有許多，如感受態(tài)細(xì)胞效率、插入片段質(zhì)量、基因結(jié)構(gòu)、插入片段長(zhǎng)度、插入片段和載體的比例等。如發(fā)現(xiàn)克隆數(shù)少或克隆效率低，可嘗試下列方法：
? 感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率對(duì)克隆數(shù)有重要影響，轉(zhuǎn)化效率高低與連接產(chǎn)物克隆數(shù)的多少不呈線性關(guān)系。假設(shè)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率為1×109 cfu/μg DNA時(shí)，克隆數(shù)為1000；轉(zhuǎn)化效率為1×108 cfu/μg DNA時(shí)，克隆數(shù)并不是100，而是低于100。為保證克隆數(shù)，請(qǐng)選用高轉(zhuǎn)化效率的Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞。
? 使用新鮮的PCR產(chǎn)物：PCR產(chǎn)物于2-8℃保存，1-2天內(nèi)使用。對(duì)于膠回收產(chǎn)物，應(yīng)盡量縮短紫外照射時(shí)間并適當(dāng)延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間 (10-15分鐘)。
? 目的片段濃度極低時(shí)，進(jìn)行濃縮，以保證反應(yīng)時(shí)分子碰撞機(jī)率。
? 毒基因：使用Trans10感受態(tài)細(xì)胞。
? 具有特殊結(jié)構(gòu) (高AT/高GC/反向重復(fù)序列) 的基因：適當(dāng)延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間至10-20分鐘。
Q：PCR鑒定重組子失敗？
A：當(dāng)用通用引物鑒定重組子，沒有得到目的擴(kuò)增產(chǎn)物，又沒有載體自連帶，說明PCR失敗。重新優(yōu)化PCR條件或提取質(zhì)粒，以質(zhì)粒作模板擴(kuò)增或酶切鑒定包含重組子的克隆。
Q：重組克隆呈現(xiàn)淡藍(lán)色或“Fish eye”？
A：插入片段沒有影響LacZ基因讀碼框，或插入片段太短 ，這種情況下克隆呈現(xiàn)淡藍(lán)色或“Fish eye”，可正常鑒定。
